近日，宝藤生物与上海东方肝胆外科医院胆道外科合作，通过对不同患病时间的胆囊结石患者和胆囊癌患者的手术组织样本进行转录组测序，揭示了胆囊结石的携带时间与患胆囊癌风险的关系。研究成果《RNA Sequencing Revealed Signals of Evolution From Gallbladder Stone to Gallbladder Carcinoma》于2020年5月发表于frontiers in Oncology。

研究背景

胆囊癌发病率低，但是恶性程度极高，平均总生存期仅为6个月左右，5年生存率约为10%。由于胆囊癌早期无明显症状，因此患者确诊时多已发展为晚期。胆囊结石是胆囊癌的第一大危险因素，胆囊结石的患者，由于结石对胆囊壁的长期刺激，胆囊壁会增生变厚，从增生/化生，到异常增生，再到癌变，这个过程大概需要5到15年的时间。腹腔镜胆囊切除是治疗有症状胆囊结石的首选策略，那么对于没有症状的胆囊结石需要做手术吗？

研究目的

在临床中，有症状的胆结石患者首选手术治疗，而对于无症状的胆结石患者进行长期随访观察。当观察时间过长时，临床上也建议把手术做掉为妙。但是无症状患者对于胆囊切除手术往往是持拒绝态度的。

无症状胆囊结石长期携带会拖成胆囊癌吗？这也是让无数临床医生感到困惑的问题。本研究探查了不同随访时间的胆囊结石患者和胆囊癌患者，其胆囊组织在转录水平上的相似性、差异性，以及结石转癌的进化关系。

研究方法

本研究入组30例胆囊结石患者，其中10例患者初诊至手术时间为1-3年（GS3），10例患者为5-10年(GS5)，10例患者>10年(GS10)。取患者的术后胆囊粘膜组织进行RNA-seq分析。同时入组10例病理确诊的胆囊癌患者(GBC)，取癌和癌旁组织进行RNA-seq分析。

体外实验：对胆囊癌细胞系GBC-SD、SGC-996以及GPR-87 knockdown细胞系GBC-SD shGPR-87、SGC-996 shGPR-87，分别进行细胞克隆形成、细胞扩增、细胞迁移/侵袭实验。

图1 研究流程示意图

研究结果

胆囊癌 vs. 癌旁

与癌旁相比，胆囊癌组织中发现1704个差异表达基因，其中523个基因表达水平上调，1181个基因表达水平下调（图2A）。KEGG信号通路富集分析表明，几条著名的癌症相关信号通路发生改变如PI3K-Akt、MAPK、Ras、Wnt等（图2C）。其中富集最显著的信号通路是neuroactiveligand-receptor interaction。胆道系统的恶性肿瘤有一个共同的生物学特性就是沿管壁呈浸润性生长，特别容易发生神经侵犯，已有研究表明神经侵犯是肿瘤复发的一个重要因素。

图2 胆囊癌vs.癌旁（A）差异表达基因火山图；（B）差异表达基因热图；（C）差异表达基因信号通路富集分析结果（TOP15）。

胆囊结石vs. 胆囊癌

图3和图4表明胆囊结石患者与胆囊癌患者的相似性由低到高分别是5-10年（GS5）、10年(GS10)和1-3年(GS3)患者。我们认为胆囊组织与胆囊癌的转录组越相似，患癌风险越高。

图3 (A) 与胆囊癌比，胆囊结石的差异表达基因数目；（B）胆囊癌、胆囊结石（GS3/GS5/GS10）基于转录组测序的韦恩图。

通过韦恩图分析（图4B），我们发现了与胆囊结石患者癌变风险最相关的40个基因。对这40个基因进行信号通路富集分析，发现其主要与免疫相关。通过对40个基因的表达水平做时序分析，我们发现两个非常有意思的基因ALPP和GPR87。这两个基因在GS5组（风险最低组）不表达，其表达水平随患癌风险升高而升高（图4D、E）。

图4（A）不同时间分组的胆结石患者的患癌风险排序；（B）韦恩图寻找关键基因；（C）40个关键基因的信号通路分析；（D,E）ALPP和GPR87基因表达水平时序分析。

体外实验表明，GPR87敲减后的胆囊癌细胞系，与对照细胞系比，其扩增、克隆形成能力、侵袭和转移能力均受到抑制，证明GPR87在胆囊癌变过程中起关键作用。

图5 GPR87敲减的体外实验。（A）Western blotting验证GPR87敲减后的蛋白表达水平；（B）qPCR验证GPR87敲减后的基因表达水平；（C）细胞扩增能力实验；（D）克隆形成能力实验；（E）Edu细胞增殖检测。

讨论

为什么随访5-10年的胆结石患者患癌风险最低，而1-3年和>10年的患者风险更高？这似乎不符合我们的预期。临床专家给出以下解释：临床上收集的30例胆结石患者，都是由于患者伴有临床症状如胆绞痛、胆囊炎等，符合手术指征，从而行胆囊切除术。1-3年的胆结石患者是临床上发病急、病情进展快的一组患者。我们的分析结果表明，症状出现早、发病急是高癌变风险的一个早期预警。而随访时间>10年的患者，尽管患者无临床症状或症状出现晚，但是胆囊长期遭受慢性粘膜创伤和炎症刺激，而炎症刺激被认为是胆囊癌变的关键驱动因素。

临床治疗上，我们给出哪些建议？

对于有临床症状、达到手术指征的胆结石患者，建议行胆囊切除术。对于无症状的胆结石患者建议临床观察随访。当胆结石携带时间超过10年时，患癌风险增加，建议手术切除。

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